CÁC XÉT NGHIỆM ĐÁNH GIÁ CHỨC NĂNG TINH TRÙNG
– Đo nồng độ các gốc oxy hoá tự do và chất kháng oxy hoá
– Đo nồng độ các gốc oxy hoá tự do
– Đánh giá nồng độ chất kháng oxy hoá
CÁC KHẢO SÁT VỀ KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC CỦA TINH TRÙNG
- Thử nghiệm khả năng gắn kết của tinh trùng
- Phân tích tỉ lệ tinh trùng gắn kết lên ZP
- Xét nghiệm hemizona (HZA)
- Thử nghiệm gắn kết với hyaluronan (Hyaluronan binding assay – HBA)
- Phản ứng cực đầu
- Sự tương tác giữa tỉnh trùng và bào tương noãn (Sperm penetration assay – SPA)
ĐÁNH GIÁ SỰ NGUYÊN VẸN DNA CỦA TINH TRÙNG
- Khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất tình trùng (SCSA)
- Phương pháp đánh dấu đứt gãy DNA bằng các dỤT được xúc tác bởi enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL)
- Điện di cá thể tế bào đơn (COMET assay)
- Phương pháp khảo sát sự phân tán nhiễm sắc chất tỉnh trùng (SCD)
CHUẨN BỊ TINH TRÙNG TỪ TINH DỊCH
Chuẩn bị tinh trùng là một khâu quan trọng không thể thiếu trong qui trình thụ tinh trong ống nghiệm. Việc chuẩn bị tinh trùng với mục đích đầu tiên là tách tinh trùng di động ra khỏi tinh dịch và cô đặc trong một thể tích nhỏ để sẵn sàng cho việc điều trị. Các kĩ thuật chuẩn bị tinh trùng hiện nay chủ yếu dựa trên sự di động, lực ly tâm đẳng tỉ trọng hoặc ái lực của tinh trùng với các chất kết dính. Sinh lý của tinh trùng và sinh lý sự thụ tinh phải được xem xét khi lựa chọn một phương pháp chuẩn bị tinh trùng nhằm phân lập được những tinh trùng sống nhưng vẫn bảo tồn được chức năng của chúng tránh khỏi những tác động của quá trình xử lý mẫu
CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ TINH TRÙNG
Rửa đơn thuần
Rửa đơn thuần là phương pháp chuẩn bị tỉnh trùng đơn giản và cổ điển nhất được áp dụng trong thụ tinh nhân tạo. Tinh dịch được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy theo tỉ lệ 1:1, sau đó tiến hành ly tâm (2 – 3 lần) để loại bỏ tinh tương (tốc độ ly tâm 300-500g). Sau khi ly tâm, phần cặn thu được sẽ được đánh giá mật độ và di động, sau đó được dùng cho điều trị.
Rửa đơn thuần không phải là phương pháp tối ưu cho chuẩn bị tinh trùng. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng chỉ loại bỏ được tinh tương, trong khi tinh trùng chết, tinh trùng bất thường, các tế bào trong tinh dịch như các tế bào mầm ống sinh tinh, bạch cầu, tế bào biểu mô,… vẫn hiện diện trong quần thể tinh trùng sau khi rửa. Sự hiện diện của các tế bào không phải tinh trùng này có thể gây ức chế khả năng thụ tinh của tinh trùng và tăng sự sản sinh ROS khi ly tâm. Do đó, hiện nay phương pháp này chỉ được áp dụng trong một số trường hợp có quá ít tinh trùng khi chuẩn bị cho ICSI.
Chuẩn bị tinh trùng dựa trên sự di chuyển
Trong in vivo, những tinh trùng tiềm năng có khả năng tự di chuyển ra khỏi tinh dịch để đi qua dịch nhầy cổ tử cung. Tương tự, tinh trùng di động tốt có khả năng di chuyển ra khỏi tinh dịch vào môi trường cấy. Dựa vào đặc điểm này, hai phương pháp bơi lên và bơi xuống được xây dựng trong chuẩn bị tinh trùng. Tinh trùng có thể được rửa đơn giản để thu cặn trước khi thực hiện bơi lên hay bơi xuống hoặc thực hiện trực tiếp với mẫu tinh dịch. Tuy nhiên, khuyến cáo không nên ly tâm tinh dịch để thu cặn trước do việc ly tâm nhiều lần có thể làm tăng ROS gây ảnh hưởng chất lượng tinh trùng
Phương pháp bơi lên
Đây là một trong những phương pháp thường được sử dụng trong chuẩn bị tinh trùng. Tinh dịch được đặt dưới một lớp môi trường và ủ trong tủ ấm 37°C từ 30 – 45 phút để tinh trùng bơi lên. Nên sử dụng ống đáy tròn và đặt nghiêng khoảng 30° – 40° để tăng diện tích tiếp xúc giúp tăng khả năng thu nhận tinh trùng bơi lên. Sau thời gian ủ, hút khoảng 2/3 đến 3/4 lớp môi trường bên trên để ly tâm và tái huyền phù cặn. Mẫu được đánh giá mật độ và di động trước khi sử dụng.
Trong phương pháp bơi lên, các tinh trùng di động tốt sẽ di chuyển ngược trọng lực và tách ra khỏi tinh dịch, trong đó có thể có các tinh trùng bất thường, các tinh trùng chết và bất động nằm trong lớp tinh tương. Thời gian ủ cần phải phù hợp, vì nếu kéo dài sẽ có nhiều tỉnh trùng di động kém bơi lên, trong khi thời gian quá ngắn thì số lượng tinh trùng thu được rất ít. Ưu điểm của phương pháp này là thu nhận được quần thể tinh trùng có độ di động tốt và dễ thực hiện. Phương pháp này còn hiệu quả về mặt chi phí do chỉ sử dụng môi trường cấy tinh trùng. Tuy nhiên, phương pháp bơi lên chỉ phù hợp với những mẫu có tỉ lệ di động tốt và mật độ cao. Những trường hợp chuẩn bị tinh trùng cho IUI với mẫu có mật độ thấp hoặc di động yếu thường ít áp dụng phương pháp này do hiệu suất thu hồi thấp. Ngoài ra, thời gian cấy kéo dài cũng gây bất lợi cho tinh trùng, đặc biệt những trường hợp có kháng thể kháng tinh trùng
Phương pháp bơi xuống
Trong phương pháp bơi xuống, những tinh trùng có hình dạng bình thường, di động tốt sẽ di chuyển theo trọng lực để tách khỏi tỉnh dịch và đi đến môi trường bên dưới có độ nhớt cao hơn. Tinh trùng sau khi rửa được đặt bên trên lớp môi trường có độ nhớt cao (có chứa 7,5% huyết thanh bỏ hoặc 20% huyết thanh người) và ủ 30 phút, nghiêng 45° trong tủ cấy. Sau thời gian ủ, lớp tinh dịch bên trên được loại bỏ từ từ. Phần môi trường bên dưới được pha loãng và ly tâm để thu cặn chứa tinh trùng. Phương pháp bơi xuống cho mẫu tinh dịch sau chuẩn bị tốt hơn phương pháp bơi lên nhưng tỉ lệ có thai lại thấp hơn mà không giải thích được nguyên nhân. Hiện nay, phương pháp này ít được sử dụng trong điều trị.
Chuẩn bị tinh trùng dựa trên tỉ trọng
Có hai phương pháp được áp dụng để phân tách tinh trùng dựa trên tỉ trọng hoặc tỉ trọng riêng: thang nồng độ liên tục và không liên tục. Đối với phương pháp thang nồng độ liên tục, tỉ trọng các vật liệu thay đổi liên tục từ thấp đến cao, từ phần trên xuống đáy, trong khi ở phương pháp thang nồng độ không liên tục sử dụng các lớp có tỉ trọng giảm dần và lớp tỉ trọng thấp ở trên lớp tỉ trọng cao.
Phương pháp thang nồng độ không liên tục là một trong hai phương pháp phổ biến được sử dụng trong chuẩn bị tinh dịch ở người. Trong phương pháp này, mặt phân cách giữa các lớp tạo nên một bước chuyển về tỉ trọng nhằm ngăn cản những tế bào, vật liệu di truyền đi qua một cách dễ dàng. Các hạt keo silica với tính chất ở dạng keo không bị hòa tan, có độ nhớt thấp, không ngăn cản việc lắng của tinh trùng nên chúng được coi là vật liệu lý tưởng cho việc chuẩn bị tinh trùng. Tinh trùng trưởng thành, hình dạng bình thường có tỉ trọng lớn hơn 1,12 g/ml, trong khi những tinh trùng chưa trưởng thành hoặc bất thường có tỉ trọng vào khoảng 1,06 đến 1,09 g/ml. Tỉ trọng riêng của hạt keo silica ở nồng độ 40% và 80% của Percoll vào khoảng 1,06 và 1,10 g/ml. Do đó, chỉ những tinh trùng bình thường, trưởng thành mới có thể đi qua lớp bên dưới Phương pháp này được sử dụng phổ biến theo sau bởi sự thương mại hoá hạt keo silica được phủ bởi polyvinylpyrrolidone – Percoll, tuy nhiên, do mối lo ngại về nội độc tố sinh ra nên Percoll không còn được sử dụng trong chuẩn bị tinh trùng người. Độc tố của các keo silica được giảm bớt nhờ được bao phủ bởi phân tử silane, bao gồm các sản phẩm được thương mại hoá như PureSperm™™™, Sil-Select™, SupraSperm™™, SpermGrad™ và một số sản phẩm khác.
Ưu điểm của phương pháp thang nồng độ là áp dụng được trên tất cả các mẫu, bao gồm mẫu có độ nhớt cao, mẫu có số lượng tinh trùng ít và khả năng di động kém với tỉ lệ thu hồi cao. Quần thể tinh trùng thu nhận được có di động tốt, phân lập được tinh trùng có chất lượng DNA tốt, loại bỏ được bạch cầu, vi khuẩn. Mặt phân cách giữa các lớp nồng độ là thiết yếu cho việc phân tách các lớp tinh trùng với chất lượng khác nhau nên cần chú ý khi thao tác. Những tinh trùng di động thu được sau khi ly tâm thường được loại bỏ môi trường lọc bằng cách rửa và ly tâm. Nhược điểm của phương pháp này là sử dụng môi trường thang nồng độ có giá thành cao và có khả năng sinh ra nội độc tố nếu không được loại bỏ sạch sau quá trình ly tâm
Các phương pháp cải tiến khác
Phương pháp dùng cột lọc
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc chuyển động của tinh trùng và khả năng gắn kết với sợi thuỷ tinh. Những tinh trùng chết hoặc tinh trùng di động yếu rất “dính”, dễ bị gắn vào bề mặt thuỷ tinh khi có sự hiện diện của các protein (hiện tượng “dính vào thuỷ tinh”); trong khi các tinh trùng sống có khả năng tự bơi qua các sợi lọc thuỷ tinh này. Khả năng thành công của phương pháp này tùy thuộc vào loại sợi thuỷ tinh được sử dụng. Có ba loại lọc được sử dụng gồm: cột thuỷ tinh, sợi thuỷ tinh và hạt thuỷ tinh. Toàn bộ tinh dịch được sử dụng cho phép thu nhận được một lượng lớn tinh trùng di động, phù hợp với những mẫu tinh trùng ít hoặc yếu và mẫu xuất tinh ngược dòng. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, thu được nhiều tinh trùng di động và giảm đáng kể lượng ROS. Tuy nhiên, nhược điểm khiến cho phương pháp này không được sử dụng phổ biến là do giá thành cao và mẫu sau lọc không được tinh sạch như những phương pháp khác
Phương pháp phân loại tinh trùng bằng từ tính – MACS (Magnetic activated cell sorting)
Một trong những biểu hiện đầu tiên của quá trình chết theo chu trình của tinh trùng là sự mất đi tính toàn vẹn của màng tế bào làm cho chúng xảy ra hiện tượng tái cấu trúc màng, bộc lộ phospholipid phosphatidylserine (PS), kích hoạt con đường apoptosis. PS là một phân tử có ái lực cao với annexin V. Phương pháp MACS sử dụng annexin V như một chất đánh dấu những tỉnh trùng apoptosis. Khi mẫu tỉnh trùng được nạp vào cột chứa các hạt có lực từ, tinh trùng bị apoptosis sẽ gắn với các annexin V liên hợp với các hạt bead (phần dương tính với annexin V – MACS+), những tỉnh trùng không bị apoptosis sẽ đi qua cột (phần âm tính với annexin V – MACS-) và được thu nhận sử dụng cho quy trình IVF.
Phương pháp chọn lọc tinh trùng bằng hệ thống vi lưu (Microfluidic sorting chip)
Microfluidic (vi lưu) được áp dụng và phát triển trong nhiều lĩnh vực, trong đó có lĩnh vực TTTON. Hệ thống microfluidic được tạo ra để lựa chọn tinh trùng có độ di động và hình dạng bình thường từ mẫu tinh trùng tươi mà không cần ly tâm.
Hệ thống vi lưu còn được gọi là “lab-on-a- chip” là một phức hợp siêu nhỏ được tích hợp trên một con chip. Hệ thống này gồm có bơm, khoang chứa, khoang trộn, các van đóng mở có khả năng điều khiển được, có thể có một hoặc nhiều kênh dẫn với ít nhất một kênh có kích thước nhỏ hơn 1mm. Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm thời gian, không cần ly tâm, tỷ lệ di động của tinh trùng sau lọc rửa gần như 100%, tỷ lệ phân mảnh và nồng độ ROS thấp hơn so với các phương pháp khác
CÁC YẾU TỐ CẦN QUAN TÂM TRONG CHUẨN BỊ TINH TRÙNG
Lựa chọn một phương pháp chuẩn bị tinh trùng
Có nhiều phương pháp đã được báo cáo để lựa chọn tinh trùng. Tuy nhiên, các yêu cầu được đặt ra cho một phương pháp chuẩn bị tinh trùng tốt bao gồm:
– Loại trừ được tinh dịch, các nhân tố ức chế hoạt hoá tinh trùng
– Hạn chế sự hiện diện của các tinh trùng chết/ mất chức năng trong mẫu sau lọc rửa
– Loại trừ bạch cầu, các tác nhân khác như vi khuẩn trong mẫu
– Thu nhận được số lượng tinh trùng di động, nguyên vẹn DNA và hình dạng bình thường với tỉ lệ thu hồi cao
– Chi phí hiệu quả
– Đơn giản, dễ thực hiện
– Cho phép thực hiện trên số lượng mẫu lớn
Tuy nhiên, do chưa có một phương pháp nào đáp ứng được tất cả những yêu cầu trên đây, mỗi lab bắt buộc phải thực hiện được nhiều kĩ thuật khác nhau để xử lý dựa trên đặc điểm mẫu và mục đích điều trị IUI, IVF hay ICSI.
Trang thiết bị, dụng cụ cần thiết
Để ngăn ngừa việc lây nhiễm từ mẫu tinh dịch, việc xử lý tinh trùng thường được đặt trong một khu vực thao tác riêng với không gian vô trùng có thể được tạo ra và kiểm soát bằng tủ thao tác. Ngoài ra, một trong những thiết bị quan trọng trong chuẩn bị tinh trùng là máy ly tâm. Để thu được số lượng tinh trùng nhiều và tăng hiệu suất của quá trình lọc rửa, nên sử dụng máy ly tâm với trục văng ngang thay thế cho máy ly tâm có trục cố định. Số vòng quay sẽ được tính dựa trên lực g mong muốn và bán kính của trục theo từng máy ly tâm.
Môi trường chuẩn bị tinh trùng
Môi trường sử dụng trong chuẩn bị tinh trùng phụ thuộc vào phương pháp chuẩn bị và mục đích sử dụng. Mỗi lab nên thực hiện các thử nghiệm để chọn ra môi trường hiệu quả nhất trong điều kiện của lab. Đặc biệt, cần tuân thủ các hướng dẫn về bảo quản và sử dụng môi trường của nhà sản xuất. Ngoài ra, môi trường chuẩn bị tinh trùng cần có sự hiện diện của ion bicarbonate để đảm bảo sự cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào tinh trùng hay sự khả năng hoá của tinh trùng diễn ra trong điều kiện in vitro.
Đối với phương pháp thang nồng độ, việc ly tâm được thực hiện bên ngoài tủ cấy nên cần chọn môi trường có hệ đệm “bến” (ví dụ: hệ đệm HEPES) được gọi là “hệ đệm rửa tinh trùng”. Trong phương pháp bơi lên, có thể sử dụng môi trường với “hệ đệm rửa tinh trùng”, các ống nghiệm chứa môi trường nên đậy chặt nắp khi đặt vào tủ ấm (không có CO₂) để hạn chế sự thay đổi pH của môi trường.
Đối với tinh trùng chuẩn bị cho ICSI có thể được xử lý và tái huyền phù trong môi trường không có hệ đệm tinh trùng vì sự khả năng hoá tinh trùng là không cần thiết khi ICSI. Trong IUI, hệ đệm tinh trùng nên được sử dụng nhằm hạn chế sự thay đổi pH của môi trường trong quá trình thao tác để ngăn cản sự khả năng hoá của tinh trùng chưa trưởng thành trước khi bơm (hệ đệm sẽ được pha loãng rất nhiều sau khi bơm và không có hại cho tinh trùng). Trong IVF cổ điển, môi trường với hệ đệm bicarbonate cần được sử dụng để hỗ trợ quá trình khả năng hoá của tinh trùng. Tuy nhiên, nếu khoảng thời gian cấy noãn và đến khi cấy thụ tinh quá lâu thì nên tái huyền phù tỉnh trùng vào dung dịch đệm tinh trùng, giữ chúng ở nhiệt độ môi trường cho tới hai giờ trước khi cấy, sau đó rửa bằng môi trường thụ tinh và ủ trong tủ cấy CO, khoảng 90 phút trước khi thụ tinh cho noãn.
Thời gian và tốc độ ly tâm
Lực ly tâm thường được áp dụng để thu nhận tinh trùng tối ưu là 300 – 500g. Tốc độ ly tâm chậm (lực g thấp) chỉ làm giảm lượng tinh trùng thu được mà không cải thiện chất lượng và tốc độ ly tâm cao hơn không làm tăng lượng tinh trùng thu được cho đến khi phương pháp này đạt được khả năng tách biệt tối đa (khoảng 20 phút tất cả tinh trùng đã tiến đến điểm tách biệt của chúng)
Một số nghiên cứu khác cho thấy, việc ly tâm trong phương pháp thang nồng độ có thể gây hại cho sự toàn vẹn DNA tinh trùng, đặc biệt là ở những mẫu tinh trùng di động kém, hình dạng bất thường. Những mẫu này tạo ra một nồng độ ROS bệnh lý cao (gây ra bởi những tinh trùng có hình dạng bất thường) và có khả năng kháng oxy hoá thấp hơn khi so sánh với nam giới bình thường. Do đó, ly tâm liên tục trong thời gian kéo dài có thể là nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng ROS và làm mất chức năng tinh trùng, tăng sự phân mảnh DNA trong quá trình ly tâm. Một số tác giả đề nghị rằng thời gian ly tâm quan trọng hơn lực ly tâm trong việc hình thành ROS trong tinh dịch, do đó, cần hạn chế thời gian ly tâm và số lần ly tâm trong quá trình chuẩn bị tinh trùng
Xử lý mẫu nhiễm
Sự kết hợp giữa phương pháp thang nồng độ và sau đó là bơi lên được coi là giải pháp tốt nhất để chuẩn bị tinh trùng từ những mẫu tinh dịch bị nhiễm bệnh nhằm tránh lây cho người vợ. Việc kết hợp này giúp tách những tế bào di động khỏi những tế bào bị nhiễm virus và tinh tương. Tuy nhiên, bệnh nhân nên được điều trị bằng thuốc kháng virus trước khi chuẩn bị tinh trùng. Mặt khác, mẫu xác định không có hiện diện virus mới được sau khi chuẩn bị cần phải được xét nghiệm để sử dụng cho điều trị Quản lý rủi ro
Đảm bảo an toàn người bệnh là một trong những yếu tố rất quan trọng trong y tế cũng như trong ngành hỗ trợ sinh sản. Việc chống nhầm lẫn mẫu khi thao tác là một trong những yếu tố cần được quan tâm khi chuẩn bị tinh trùng. Để tránh nhầm lẫn, tất cả lọ chứa mẫu và dụng cụ chứa phải được dán nhãn để xác định tên chồng, vợ, năm sinh và có mã bệnh nhân riêng. Ngoài ra, cần tuân thủ nghiêm ngặt việc thực hiện kiểm tra chéo ở mỗi bước đặt mẫu và chuyển mẫu giữa các vật chứa cũng như qui trình chuẩn trong quá trình chuẩn bị tinh trùng. Đối với những mẫu nhiễm, cần có qui trình xử lý riêng phòng ngừa lây nhiễm chéo và đảm bảo an toàn cho nhân viên y tế khi thao tác.
KẾT LUẬN
Chuẩn bị tinh trùng là một kĩ thuật quan trọng trong lab HTSS. Kết quả của quá trình chuẩn bị tinh trùng có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả điều trị của bệnh nhân. Chính vì vậy, cần chuẩn hoá qui trình thực hiện và có một chương trình quản lý chất lượng thích hợp trong mỗi lab để đảm bảo hiệu quả cho việc chuẩn bị tinh trùng.
